Page 58 - Influenza Report

58 Influenza Aviaria

di AIV che raggiungono la sensibilita' delle uova di gallina
embrionate (Seo 2001).

(ii) un approccio piu' rapido, specialmente quando si cerca di escludere
l'infezione, usa tecniche molecolari, che devono seguire anch'esse uno
stile a cascata: la presenza di RNA specifici di influenza A e'
determinabile tramite la reverse transcription-polymerase chain
reaction (RT-PCR) che usa come bersaglio frammenti del gene M, il
segmento piu' conservato del genoma del virus dell'influenza
(Fouchier 2000, Spackman 2002), o il gene del nucleocapside
(Dybkaer 2004).
Quando si ottiene un risultato positivo, e' necessario eseguire RT-PCR
che amplificano frammenti del gene dell'emagglutinina dei sottotipi
H5 e H7 per determinare la presenza di AIV di nota (Dybkaer 2004,
Spackman 2002). Se di nuovo positivo, una diagnosi molecolare del
patotipo (LP contro HP) e' possibile dopo aver sequenziato un
frammento del gene HA che ricopre il sito di scissione
endoproteolitico. Isolati che presentano aminoacidi multipli di tipo
basico sono classificati come HPAI. sono in fase di progettazione
tecniche di PCR e altre tecniche di DNA per l'identificazione di ceppi
H5N1 di discendenza asiatica (Collins 2002, Payungporn 2004, Ng
2005). Sottotipi non H5/H7 possono essere identificati con RT-PCR
canonica e una conseguente analisi della sequenza della subunita' HA-
2 (Phipps 2004). Esistono anche primers specifici per ogni sottotipo
NA. E' possibile ottenere una completa caratterizzazione entro tre
giorni, specialmente quando vengono usate tecniche di real time PCR
(Perdue 2003, Lee and Suarez 2004). Inoltre, sono al momento in fase
di sviluppo DNA chips che dovrebbero ulteriormente ottimizzare la
tipizzazione dei virus AI (Li 2001, Kessler 2005). Una diagnosi di
esclusione e' possibile entro un solo giorno lavorativo.

Gli svantaggi della diagnosi molecolare stanno nel prezzo che si deve
pagare per l'acquisto di consumabili ed equipaggiamento, anche se,
quando a disposizione, e' possibile analilzzare molti campioni con
meno personale in tempi molto piu' corti rispetto all'isolamento di
virus in uova. Tuttavia, bisogna ammettere che ogni PCR o reazione
di ibridizzazione, contrariamente all'isolamento del virus nelle uova,
contiene un'incertezza intrinseca dovuta alla possibile presenza di
mutazioni specifiche in un particolare isolato nei siti di legame dei
primer e/o di sonde e che possono rendere il test un falso negativo.
Quindi una combinazione di metodi molecolari (ad esempio per avere uno
screening) e classici (ad esempio per una caratterizzazione finale degli isolati e una
conferma della diagnosi di un caso all'indice) possono essere utili per
controbilanciare gli svantaggi dei due principi.
Sono state disegnate prove rapide per scoprire antigeni virali in tissue impression
smears (strisci per impronta diretta) e in sezioni al criostato usando
immunofluorescenza, o usando il saggio di cattura di antigene legato ad un enzima