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58   Influenza Aviaria


                                      di AIV che raggiungono la sensibilita' delle uova di gallina
                                      embrionate (Seo 2001).

                              (ii)    un approccio piu' rapido, specialmente quando si cerca di escludere
                                      l'infezione, usa tecniche molecolari, che devono seguire anch'esse uno
                                      stile a cascata: la presenza di RNA specifici di influenza A e'
                                      determinabile tramite la reverse transcription-polymerase chain
                                      reaction (RT-PCR) che usa come bersaglio frammenti del gene M, il
                                      segmento piu' conservato del genoma del virus dell'influenza
                                      (Fouchier 2000, Spackman 2002), o il gene del nucleocapside
                                      (Dybkaer 2004).
                                      Quando si ottiene un risultato positivo, e' necessario eseguire RT-PCR
                                      che amplificano frammenti del gene dell'emagglutinina dei sottotipi
                                      H5 e H7 per determinare la presenza di AIV di nota (Dybkaer 2004,
                                      Spackman 2002). Se di nuovo positivo, una diagnosi molecolare del
                                      patotipo (LP contro HP) e' possibile dopo aver sequenziato un
                                      frammento del gene HA che ricopre il sito di scissione
                                      endoproteolitico. Isolati che presentano aminoacidi multipli di tipo
                                      basico sono classificati come HPAI. sono in fase di progettazione
                                      tecniche di PCR e altre tecniche di DNA per l'identificazione di ceppi
                                      H5N1 di discendenza asiatica (Collins 2002, Payungporn 2004, Ng
                                      2005). Sottotipi non H5/H7 possono essere identificati con RT-PCR
                                      canonica e una conseguente analisi della sequenza della subunita' HA-
                                      2 (Phipps 2004). Esistono anche primers specifici per ogni sottotipo
                                      NA. E' possibile ottenere una completa caratterizzazione entro tre
                                      giorni, specialmente quando vengono usate tecniche di real time PCR
                                      (Perdue 2003, Lee and Suarez 2004). Inoltre, sono al momento in fase
                                      di sviluppo DNA chips che dovrebbero ulteriormente ottimizzare la
                                      tipizzazione dei virus AI (Li 2001, Kessler 2005). Una diagnosi di
                                      esclusione e' possibile entro un solo giorno lavorativo.

                                      Gli svantaggi della diagnosi molecolare stanno nel prezzo che si deve
                                      pagare per l'acquisto di consumabili ed equipaggiamento, anche se,
                                      quando a disposizione, e' possibile analilzzare molti campioni con
                                      meno personale in tempi molto piu' corti rispetto all'isolamento di
                                      virus in uova. Tuttavia, bisogna ammettere che ogni PCR o reazione
                                      di ibridizzazione, contrariamente all'isolamento del virus nelle uova,
                                      contiene un'incertezza intrinseca dovuta alla possibile presenza di
                                      mutazioni specifiche in un particolare isolato nei siti di legame dei
                                      primer e/o di sonde e che possono rendere il test un falso negativo.
                           Quindi una combinazione di metodi molecolari (ad esempio per avere uno
                           screening) e classici (ad esempio per una caratterizzazione finale degli isolati e una
                           conferma della diagnosi di un caso all'indice) possono essere utili per
                           controbilanciare gli svantaggi dei due principi.
                           Sono state disegnate prove rapide per scoprire antigeni virali in tissue impression
                           smears (strisci per impronta diretta) e in sezioni al criostato usando
                           immunofluorescenza, o usando il saggio di cattura di antigene legato ad un enzima
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